凍干對熒光探針和熒光染料有防護作用,凍干可防止探針和染料降解,提高反應的靈敏度和特異性。接著介紹一下熒光探針和熒光染料的特性。熒光探針是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入熒光探針,探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。熒光染料是在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應是否特異。低溫預凍,低溫真空干燥,過程隔離氧氣水分,凍干法可*防止熒光物質(zhì)降解。試劑凍干機Pilot3-6T IVD方面應用示例(熒光PCR):
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